Dermatoses parasitaires des Ruminants
 

 

---------------Culture mycologique---------------

 

La culture mycologique est la méthode de référence pour l’identification des espèces de Dermatophytes. Elle est aujourd´hui, grâce aux milieux DTM, réalisable en clinique avec un équipement minimal, mais reste parfois difficile : la culture de Trichophyton verrucosum, agent principal des teignes des ruminants, est longue et contraignante, et il est souvent difficile en pratique rurale d´obtenir des prélèvements non contaminés.

 

LES AFFECTIONS A RECHERCHER
  • Dermatophytes
LE MATERIEL NECESSAIRE
  • Pince
  • Lame de bistouri émoussée
  • Ciseaux
  • Ecouvillons
  • Ruban adhésif
  • Kit commercial de type DTM (« Dermatophyte Test medium ») ou milieu de Sabouraud
  • Bleu lactique
  • Lames de microscopes dégraissées
  • Lamelles
  • Microscope optique
  • Huile à immersion
LE PRELEVEMENT
  • Préparation

Les lésions choisies doivent être de préférence récentes, peu remaniées et n'ayant subit aucun traitement topique préalable.

Une légère désinfection de la zone est possible afin d'éviter le développement de champignons saprophytes tout en permettant celui des Dermatophytes.

Les poils situés en périphérie de lésions suspectes sont récoltés à l'aide de la pince, leur extrémité distale pouvant être coupée préalablement afin de n’étudier que la partie proximale parasitée.

 

  • Technique

Il est ensuite possible d’utiliser plusieurs types de milieux pour la mise en culture des prélèvements :

-un milieu de type DTM est facilement utilisable en clinique. Il est composé de nutriments (polypeptides et hydrates de carbone) nécessaires à la croissance des Dermatophytes, de cycloheximide et de chloramphénicol (pour inhiber respectivement la croissance des contaminants fongiques et bactériens) ainsi que d’un indicateur coloré de pH, le rouge de phénol (orange en milieu acide, rouge en milieu basique). L'inconvénient majeur de ce type de milieu est la nécessité d'utiliser un prélèvement non contaminé, critère parfois difficile à obtenir en médecine vétérinaire.


-le milieu de Sabouraud, contenant peptone, glucose et gélose et additionné d’antibiotiques et de cycloheximide, est utilisé en laboratoire spécialisé. Ces milieux sont disponibles chez la plupart des fournisseurs de réactifs biologiques et se présentent en poudres déshydratées ou en tubes prêts à l'emploi. Il est alors préférable de les couler en boite de Pétri pour obtenir un bon étalement du développement des colonies.


L’ensemencement du milieu est réalisé en déposant délicatement le prélèvement en surface de la gélose. L'ensemble est ensuite mis à incuber à température ambiante (20 à 25°C) ou à 37°C et observé quotidiennement pendant une à trois semaines.

L'identification est basée sur l'aspect des colonies (couleur, taille, forme), le diagnostic de certitude étant établi par la réalisation d’un drapeau de Roth. Cette technique consiste à appliquer en surface des colonies en développement un petit morceau de ruban adhésif que l’on appose ensuite sur une lame de microscope sur laquelle on a préalablement déposé une goutte de bleu de méthylène. Une seconde goutte de bleu de méthylène est déposée par-dessus, le tout est recouvert d’une lamelle et observé au microscope optique, au fort grossissement (x100), à l´immersion.

Les inconvénients sont de plusieurs types :

-L’utilisation d’un milieu DTM, riche, est parfois insuffisante pour l’identification des colonies (prolifération de mycéliums sans spores typiques). Dans ce cas, un repiquage sur un milieu de Sabouraud peut s’avérer nécessaire.

-Le temps d'incubation est long, et différent en fonction des espèces.

-Les cultures sont souvent contaminées par des champignons saprophytes.

-L'identification reste difficile.

-Dans certain cas, l'examen direct (trichogramme) est plus fiable que la culture : c'est le cas notamment de Trichophyton verrucosum, principal agent de la teigne bovine, pour lequel le développement est particulièrement long (3 semaines), et nécessite une température optimale (37°C) ainsi que des apports en thiamine et inositol.

 

INTERPRETATION

 

En cas de positivité, plusieurs modifications se produisent :
-Quelques jours après la mise en culture, l’indicateur coloré des tubes DTM vire au rouge, témoin de l’alcalinisation du milieu suite à la production de sucres par les Dermatophytes en multiplication (tubes de droite et du milieu sur la photo ci dessous). La rapidité du virage dépend de l’espèce inoculée (3 jours pour Microsporum canis, 5 jours pour Trychophyton mentagrophytes), de la température et du nombre de poils déposés.
-Ensuite (ou simultanément), on observe le développement d’une culture fongique. On note alors les couleurs recto et verso, l’aspect des colonies et leur délai d’apparition (tube de gauche).


Culture de Microsporum canis. Photo: laboratoire de parasitologie ENVL

Culture en milieu DTM de Microsporum canis. Photo: laboratoire de parasitologie ENVL.


L’observation microscopique des colonies en développement (technique du drapeau de Roth) permet d’effectuer un diagnostic d’espèce. On recherche des filaments en raquette, des spores (microconidies) et des fuseaux (macroconidies).
Souvent, l’interprétation est délicate et l’intervention d’un laboratoire spécialisé s’avère indispensable.

 

Il existe de nombreux cas de faux positifs, liés à la multiplication d’espèces de champignons saprophytes et kératinophiles qui peuvent provoquer un changement de couleur du milieu. Dans ce cas, l’indicateur coloré vire tardivement et les colonies sont souvent plus pigmentées.

 

Contaminant en milieu DMT.  Photo: laboratoire de parasitologie ENVL

Développement en milieu DMT d´un contaminant. Photo: laboratoire de parasitologie ENVL.


Il existe aussi des cas de faux négatifs liés :
-à l’utilisation d’un prélèvement de taille insuffisante et/ou pauvre en éléments fongiques,
-à un traitement antifongique en cours,
-à une durée d’incubation trop courte, une température trop faible,
-à la présence de contaminants qui empêche l’observation des dermatophytes
.

 

IDENTIFICATION DES CULTURES DE DERMATOPHYTES BOVINS
 
ESPECE
MACROSCOPIE
MICROSCOPIE
Croissance
Recto
Verso

Aspect des colonies en culture

(Recto à gauche, verso à droite)

Macroconidies
Microconidies
Eléments divers, ornementations
Microsporum canis

Rapide, 8 à 10 jours

Duvet blanc et court, chamois clair
Jaune ou orangé , parfois beige, ou non pigmenté
 Photo: laboratoire de parasitologie ENVL
Nombreuses, en navette, paroi épaisse échinulée, très cloisonnées, un pôle en capuchon, 50 à 70 µm
Piriformes, absentes ou abondantes
Mycélium en raquette
Microsporum gypseum
Rapide, 5 à 7 jours
Etoilée, chamois, en éclaboussure de plâtre
Chamois foncé
 Photo: laboratoire de parasitologie ENVL
Nombreuses, ovales, en bouquet, paroi fine, échinulées, 40 à 50 µm
Piriformes, rares ou abondantes
Trichophyton mentagrophytes
Rapide, 5 à 7 jours
Astéroïde, en éclaboussure de plâtre, blanche à beige
Jaune, brun ou rouge
Fuseaux petits (13 à 20 µm), paroi mince et lisse, nombre variable
Rondes et piriformes, en épi ou en grappes, sessiles
Nombreuses vrilles, organes pectinés, organes nodulaires, mycélium en raquette, articulation à angle droit
Trichophyton verrucosum
Lente, 3 semaines
Aspects variés, petites colonies souvent cérébriformes blanches ou ocres
Variable
Fuseaux dégénérés, rares
Rares, piriformes
Chlamydiospores parfois nombreuses, mycélium à gros renflements boursouflés
Photos: laboratoire de parasitologie ENVL